MTT细胞增殖及细胞毒性检测河北快三走势图表

使用说明书

仅供体外研究使用,不用于临床诊断!

第1版(2016年04月修订)

[关联信息]

‍    细胞增殖及细胞毒理检测实验,被广泛应用于评估一些影响细胞周期的因子,如:生长因子.细胞因子.有丝分裂原以及影响细胞分裂和增殖的药物等,成为在医学检测、药物检测以及食品和环境安全检测中的一个重要手段。

[基本原理]

   ‍ 噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT),是一种可接受氢离子的化合物染料,带正电荷,具有很强的细胞膜渗透性。当MTT进入活细胞中后,线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原成深蓝色的MTT-甲臜结晶。甲臜结晶不具有细胞膜渗透性,将会被永久的保留在活细胞内,使活细胞着色。而死细胞一方面细胞膜被破坏不具有选择透过性,另一方面不具有将MTT还原形成MTT-甲臜结晶的能力,将不会被着色。甲臜结晶在570nm波长处具有最高吸收峰,通过酶标仪检测OD570nm便能很好的反应体系中甲臜的生成量。而甲臜的生成量与活细胞数目成正比,用以评估细胞存活和增值状况。

[产品组分]  

规格

1000次

试剂A:MTT(粉末)

50 mg

试剂B:MTT溶解液

12 ml

试剂C:甲臜溶解液

120 ml

说明书

1份


[保存条件和有效期]

试剂A和试剂B需避光-20℃保存,试剂C放置于4℃保存。未开封试剂,有效期12个月。

[使用方法] 

A.实验前试剂准备

1. MTT溶液配置

  ‍ 用5ml MTT溶解液直接溶解25mg MTT粉末配制成5mg/ml的工作液,过滤除菌,该溶液可4℃ 避光短时间保存(越短越好)。建议溶解后,直接将剩余液体小剂量分装放到-20℃保存,能稳定保存3-6个月,避免反复冻融。

2. 甲臜溶解液

   甲臜溶解液低温或者常温保存可能会产生沉淀,只需37℃水浴使其充分溶解,混匀后即可使用。

B.MTT细胞增殖检测

1. 接种细胞:用含10%胎牛血清(FBS)的培养液配制成细胞悬液,调整细胞密度,以每孔5×103~2×104个细胞接种到96孔板,每孔体积100µl,同时设置调零孔(培养基+MTT+甲臜溶解液),对照孔(细胞+相同浓度的药物溶解介质+培养液+MTT+ 甲臜溶解液)。

2. 37℃,5% CO2,培养24-72h。

3. 可选:对于贴壁细胞,去除旧的培养液,更换100µl/孔新鲜的培养液(不含酚红);对于悬浮细胞,离心96孔板,去除尽可能多的上清液。然后加入100µl/孔新鲜的培养液(不含酚红)重悬细胞。

4. 每孔加入10µl MTT工作液(5mg/ml)。

5. 水平摇床上低速混匀1min后,放入37℃培养箱孵育4h。注:对于高密度的细胞(>100,000 个/孔)可缩短孵育时间至2h。

6. 对于贴壁细胞,直接吸掉旧的培养液,避免枪尖刮破单细胞层。对于悬浮细胞,离心收集细胞,去除培养液。

7. 加入100µl/孔甲臜溶解液,用枪充分混匀后放入37℃培养箱孵育4 h。

8. 孵育结束,放置在酶标仪上摇匀后,选择570nm,测定吸光度。

[注意事项] 

1. MTT溶液对温度.光照和有菌环境比较敏感,较长时间保存需低温、遮光并在无菌条件下保存。当溶液颜色变为灰绿色请勿使用。

2. MTT溶液在低温下会凝固,请置于室温或20~25℃,直到溶液全部溶解并混匀后使用。

3. 如使用96T板长时间进行细胞培养和检测,为防止液体蒸发给检测结果带来的不稳定性,可在培养板的边缘孔用无菌PBS,水或者培养液填充。

4. 在细胞培养板孔中加入甲臜溶解液后,在普通光学显微镜下注意观察甲臜的溶解情况,当甲臜正好全部溶解时进行OD570nm的检测最为准确,长时间的孵育将降低检测的灵敏度。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。

5. MTT溶液具有弱毒性,甲臜溶解液具有腐蚀性,为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套按照实验室标准操作手册进行实验。

  • MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit
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